体液游离DNA mNGS检测性能评估报告
发布日期：2021/04/24
病原微生物二代测序（mNGS）检测技术无需病原体预设，无需微生物培养，可一次性对临床标本中所有病原体进行检测，是感染性疾病临床诊断的强有力工具，当前已深入到临床，被临床医生广泛接受和应用。近期，美国加州大学旧金山分校的研究团队基于Illumina和Nanopore两大测序平台的mNGS技术通过检测体液游离DNA（cell free DNA，游离DNA）对感染性疾病进行诊断，该研究成果发表在《Nature medicine》杂志上。
mNGS技术在临床中可检测的标本类型多样，如肺活检组织、肺泡灌洗液、脑脊液、血液等。针对不同样本，mNGS采用不同实验流程，如针对肺活检组织、肺泡灌洗液等标本，通常对标本中全部核酸来检测；针对血液、脑脊液等标本，会针对微生物释放的游离核酸（如cfDNA）进行检测。与以往mNGS研究不同，本次研究以体液cfDNA作为mNGS检测类型，基于Illumina和Nanopore两个测序平台的mNGS技术分析了从低细胞量的脑脊液(CSF)到高细胞量的脓性液体(如脓肿)中的cfDNA以检测病原体，用于评估不同测序平台mNGS技术在体液cfDNA中检测性能，以及mNGS与传统培养、PCR检测性能比较。
收集了来自160名患者的182份体液标本，包括25份脓肿液，21份关节积液，32份胸水，27份腹水，35份脑脊液，13份支气管肺泡灌洗液和29份其他体液。
其中170份标本用于评估基于Illumina测序的mNGS检测准确性，在170份中前87份连续收集的标本用于比较基于Nanopore与Illumina的mNGS检测准确性。收集以上标本基于nanopore和Illumina两个测序平台进行mNGS检测及其他检测方法的验证。
从样本前处理、核酸提取、文库构建、测序和分析，Nanopore平台mNGS整体周转周期为5-7h，基于Illumina平台mNGS的整体周转时间约为24h。
以临床金标准（微生物培养，16S PCR，18S-ITS PCR）和综合标准（微生物培养，16S PCR，18S-ITS PCR，微生物试验，dPCR，临床判断）作为评估mNGS检测性能的参考标准，比较Illumina和Nanopore测序的mNGS检测细菌和真菌的敏感性和特异性。
以临床金标准为参考，Illumina mNGS对细菌检测的敏感性和特异性分别为79.2%（95% Cl，73.5–85.2%）和90.6%（95% CI，87.3–93.8%），对真菌检测的敏感性和特异性分别为90.6%（95% Cl，84.2–100%）和89.0%（95% CI，85.7–92.5%）（图5 上）；Nanopore mNGS对细菌检测的敏感性和特异性分别为75.0%（95% Cl，73.5–85.2%）和81.4%（95% CI，87.3–93.8%），对真菌检测的敏感性和特异性分别为90.9%（95% Cl，80.0–100%）和100%。
以综合标准为参考，Illumina mNGS对细菌的阳性百分比一致性(PPA)和阴性百分比一致性(NPA)分别为80.0% (95% CI 74.1-86.3%)和95.3% (95% CI 92.9-97.6%)；Nanopore mNGS对细菌的PPA和NPA分别为81.0% （95% CI 72.4-89.7%）和93.0%（95% CI 88.5-96.7%）。
研究者比较了14例标本的mNGS和细菌16S，真菌28S-ITS检测结果，发现其中有8例mNGS检测和PCR检测结果一致，另外6例检出不一致的病例中，5例仅通过mNGS检出，1例仅通过16S PCR检出，mNGS检出病原体比例更高。
7例患者分别采集血浆和病灶部位体液进行mNGS检测，结果发现患者局部体液病原体cfDNA的信号值（基于nRPM标准，nRPM为标准化的每百万条测序序列）比其血浆中高160倍，而病灶部位体液的较高水平病原体cfDNA可提升检测的灵敏度。
总结
在本次mNGS对体液cfDNA的检测性能评估中，研究人员将mNGS技术的应用扩展到多种类型体液的病原体检测中。从研究结果可以看到，基于Illumina和Nanopore平台的mNGS技术应用到不同病灶体液的细菌和真菌病原体检测中的敏感性和特异性是相当，Nanopore平台的周转周期较快，但其应用受限于该平台数据的高错误率。mNGS与16S，18S-ITS PCR的检测方法相比，其阳性检出率更高，且无需病原体预设。相比于血浆标本，提供病灶部位的体液标本可有效提高mNGS病原体检测的敏感性。
研究结论中，研究人员提出mNGS可有效用于以下场景：(1)可用于微生物培养阴性或生长缓慢情况下的病原体检测；(2)可用于罕见或不常见病原体引发感染的检测；(3)可作为危重症患者的一线检测手段；(4) mNGS可作为大量检测项目的早期替代方案，或作为临床辅助诊断的一部分。
参考文献
Gu W, Deng X, Lee M, et al. Rapid pathogen detection by metagenomic next-generation sequencing of infected body fluids[J]. Nature Medicine, 2020: 1-10.
